在尊龙凯时项目（批准号：21572100，21803030，81522042， 81773591，81530089，81673333，21861142005，21761142001和21661140001）等资助下，南京大学戈惠明、谭仁祥、梁勇等首次鉴定了微生物中催化[6+4]反应的酶家族。研究成果以“Enzyme-catalysed [6+4] Cycloadditions in the Biosynthesis of Natural Products”（天然产物生物合成中的酶催化[6+4]环加成）为题，于2019年3月13日在Nature（《自然》）在线发表。论文链接：http://doi.org/10.1038/s41586-019-1021-x。

　　周环反应是一类在反应过程中形成环状过渡态的协同反应，广泛用于有机分子的骨架构建。 [6+4]环加成反应可见于有机合成，但生物体内是否存在[6+4]反应催化酶仍系待解之谜。谭仁祥-戈惠明课题组近年来聚焦于对虾肠道菌产物研究，从Streptomyces seoulensis A01（汉城链霉菌）发酵液中发现了具有抗幽门螺旋杆菌活性的新颖大环内酯Streptoseomycin，其结构特征预示其生物合成途径可能涉及周环反应（Chem. Rev.2017, 117, 5367–5388）。通过比较分析Streptoseomycin及其类似物Nargenicin的生物合成基因簇，推测同源蛋白StmD和NgnD可能分别催化着Streptoseomycin和Nargenicin的周环反应步骤（StmD和NgnD结构见图1）。

　　如图2所示，通过分别敲除或回补StmD功能基因后的酶催化底物3反应验证，表明仅在StmD存在时，此酶才可催化3进行[6+4]周环反应直接得到化合物6和8，同时可催化[4+2]反应得到不稳定化合物7，再经过Cope重排转化为化合物6。为深刻理解[6+4]和[4+2]周环反应与[3,3]-Cope重排反应之间的关系，梁勇课题组通过密度泛函理论计算了反应的热力学和动力学。计算结果表明底物3越过单一过渡态后可歧化成两个方向，分别生成[6+4]和[4+2]反应产物，由于[6+4]产物在热力学上更稳定，[4+2]产物倾向于经Cope重排自发转化成[6+4]产物。此理论计算结果与实验观察结果相吻合，进一步佐证了上述实验推断。以上结果初步证明生物体内存在 [6+4]周环反应催化酶系。

　　随后，谭仁祥-戈惠明课题组设计了两步串联的酶反应在体外来验证周环酶的催化功能，证明了StmD和NgnD都可以同时催化[4+2]和[6+4]反应；进而又以StmD为探针，从基因数据库中挖掘鉴定出了另外三个可催化[6+4]反应的酶。此外，该课题组还获得了StmD、NgnD和101015D三个蛋白的晶体来进一步研究该反应的催化机理（图1），并通过分子对接、计算机模拟和点突变实验，阐明了此类新型环加成酶的反应机制。

　　综上所述，该项进展涉及多学科领域交叉，包括集成基因敲除、体外酶催化、量子化学计算、分子动力学模拟、蛋白晶体等技术，率先在实验和理论层面鉴定了[6+4]/[4+2]周环反应催化酶家族。拓展了人们对周环反应酶的认识，助推人造酶催化化工过程时代的到来。

图1 周环反应酶的结构和催化位点

图2 Streptoseomycin生物合成中的[6+4]和[4+2]反应